گلوتاردوکسین ها (Grxها) ﭘ ﺮ وﺗ ﺌ ﯿ ﻦ ﻫ ﺎ ﯾ ﯽ ﺑ ﺎ وزن ﻣ ﻮ ﻟ ﮑ ﻮ ﻟ ﯽ پایین ﻫ ﺴ ﺘ ﻨ ﺪ ﮐ ﻪ ﺑ ﺎ داﺷ ﺘ ﻦ ﯾ ﮏ ﮔ ﺮ وه ﺗ ﯿ ﻮ ل-دی ﺳ ﻮ ﻟ ﻔ ﯿ ﺪ در ﺟ ﺎ ﯾ ﮕ ﺎ ه ﻓ ﻌ ﺎ ﻟ ﺸ ﺎ ن در اﺣ ﯿ ﺎ ﺑ ﺮ ﮔ ﺸ ﺖ ﭘ ﺬ ﯾ ﺮ ﭘ ﯿ ﻮ ﻧ ﺪ ﻫ ﺎ ی دی ﺳ ﻮ ﻟ ﻔ ﯿ ﺪ ی ﻧ ﻘ ﺶ دارﻧ ﺪ . این پروتئین ها توسط آنزیم گلوتاتیون ردوکتاز توسط مولکول گلوتیون احیا می شوند. سپس این پروتئین خود در احیای باندهای دی سولفیدی پروتئین های دیگر دخالت دارد. اﯾ ﺰ وﻓ ﺮ م ﻫ ﺎ ی ﻣ ﺨ ﺘ ﻠ ﻔ ﯽ از Grx در ﮔ ﯿ ﺎ ﻫ ﺎ ن وﺟ ﻮ د دارد. در ﭘ ﮋ وﻫ ﺶ ﺣ ﺎ ﺿ ﺮ ﺗ ﻮ اﻟ ﯽ ژن کد کننده اﯾ ﺰ وﻓ ﺮ م OsGrx9 از ﮔ ﯿ ﺎ ه ﺑ ﺮ ﻧ ﺞ ﭘ ﻼ ﺳ ﻤ ﯿ ﺪ ﺑ ﯿ ﺎ ﻧ ﯽ pET28a، ﻫ ﻤ ﺴ ﺎ ﻧ ﻪ ﺳ ﺎ زی و ﺳ ﭙ ﺲ ﺑ ﻪ ﺳ ﻮ ﯾ ﻪ ی ﻣ ﻨ ﺎ ﺳ ﺒ ﯽ از ﺑ ﺎ ﮐ ﺘ ﺮ ی اﺷ ﺮ ﯾ ﺸ ﯿ ﺎ ﮐ ﻠ ﯽ ﺑ ﻪ ﻧ ﺎ م (DE3) Rosetta ﻣ ﻨ ﺘ ﻘ ﻞ ﺷ ﺪ . ﺑ ﺎ ﺗ ﺤ ﺮ ﯾ ﮏ ﭘ ﺮ وﻣ ﻮ ﺗ ﺮ T7 ﺑ ﻪ وﺳ ﯿ ﻠ ﻪ ی IPTG، ﻣ ﯿ ﺰ ان ﻣ ﻨ ﺎ ﺳ ﺒ ﯽ از ﭘ ﺮ وﺗ ﺌ ﯿ ﻦ ﻧ ﻮ ﺗ ﺮ ﮐ ﯿ ﺐ His-OsGrx9 در فاز محلول باکتری ﺗ ﻮ ﻟ ﯿ ﺪ شد و سپس ﺑ ﺎ اﺳ ﺘ ﻔ ﺎ ده از روش ﮐ ﺮ وﻣ ﺎ ﺗ ﻮ ﮔ ﺮ اﻓ ﯽ تمایلی ﺧ ﺎ ﻟ ﺺ ﺳ ﺎ زی ﺷ ﺪ . ﻓ ﻌ ﺎ ﻟ ﯿ ﺖ اﺣ ﯿ ﺎ ﯾ ﯽ این اﯾ ﺰ وﻓ ﺮ م ﻧ ﻮ ﺗ ﺮ ﮐ ﯿ ﺐ ﺗ ﻮ ﻟ ﯿ ﺪ ﺷ ﺪ ه ﺑ ﺎ اﺳ ﺘ ﻔ ﺎ ده از اﻧ ﺴ ﻮ ﻟ ﯿ ﻦ ﺑ ﻪ ﻋ ﻨ ﻮ ان ﺳ ﻮ ﺑ ﺴ ﺘ ﺮ ای اﻟ ﮑ ﺘ ﺮ ون ﮔ ﯿ ﺮ ﻧ ﺪ ه و حضور DTTیا GSH ﺑ ﻪ ﻋ ﻨ ﻮ ان عوامل اﺣ ﯿ ﺎ ﮐ ﻨ ﻨ ﺪ ه مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که Grx9 در محیط این ویترو به خوبی فعال می باشد. به نظر می رسد فعالیت این پروتئین در حضور GSH کاملا وابسته به pH محیط می باشد.

لطفا برای مشاهده چکیده به متن کامل (PDF) مراجعه فرمایید.

جاذبه نیرویی تاثیر گذار بر جانداران ساکن کره زمین از جمله میکروارگانیسم ها می باشد. باکتری E. coli O157:H7 عوارضی مانند اسهال خونی و سندرم اورمی همولیتیک را در انسان ایجاد نموده و ایمن سازی اصلی ترین راه مبارزه با آن می باشد. زیر واحد B سم شبه شیگا نوع 2 (STX2B) که عامل اتصال سم باکتری به سلول های هدف می باشد، از کاندیدهای واکسن نوترکیب پیشگیری از بیماری است. نظر به افزایش کمّی و کیفی بیان برخی پروتئین های نوترکیب در شرایط بی وزنی، میزان بیان پروتئین نوترکیب STX2B در شرایط بی وزنی شبیه سازی شده بر روی دستگاه کلینواستت مورد بررسی قرار گرفت. پس از تائید پروتئین نوترکیب با روش های ایمنولوژیک، بیان آن در شرایط بی وزنی انجام شد و پس از تخلیص پروتئین توسط ستون کروماتوگرافی، مقدار آن مورد سنجش قرار گرفت. نتایج یافت شده نشان دادند که علی رغم کاهش میزان بیان در شرایط بی وزنی که احتمالاً به دلیل عدم هوادهی مناسب محیط کشت بوده است، هم چنان پروتئین نوترکیب در شرایط بی وزنی تولید گردید.

آنزیم های کیتینولیتیک در تجزیه پسماندهای کیتینی نظیر پوسته سخت پوستان و دیواره سلولی قارچ ها و تولید الیگوساکاریدها از کیتین نقش دارند. خصوصیات کاتالیتیک آنها، این آنزیم ها را هدف مناسبی جهت استفاده درصنعت یا به عنوان بیوکنترل قرار داده است. در این مطالعه جهت تکثیر و همسانه سازی ژن chit 36 از جدایه بومی ایران Trichoderma atroviride PTCC 5220، آغازگرهای اختصاصی (chit36pf/chi36r) طراحی و پس از تکثیر قطعه مورد نظر، به منظور تولید پری پلاسمی در وکتور (+) pEt26b همسانه سازی و جهت بیان به باکتری E. coli BL21 -DE3 انتقال داده شد. در بررسی نتایج حاصل از SDS-PAGE هیچگونه باندی دال بر بیان پروتئین در هیچکدام از شرایط دمایی و میزان متفاوت IPTG در بخش های متفاوت سلولی مشاهده نشد. لذا در ادامه، بیان پروتئین Chit36 با حذف پپتید نشانه pelB (جهت تولید به صورت سیتوپلاسمی) همراه با توالی هیستیدین در انتهای کربوکسیلی دردستور کار قرارگرفت. باکتری حاوی سازه نوترکیب تحت شرایط القایی متفاوت مورد بررسی قرار گرفت. علیرغم عدم مشاهده هیچگونه باندی در هیچکدام از شرایط القایی با روش SDS-PAGE، بیان اندک پروتئین در 2 کلنی با استفاده از روش Western blot مورد تایید قرار گرفت. به منظور بهینه سازی شرایط بیان، میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام باکتری درشرایط متفاوت القایی، به روش سنجش کمی باند های پروتئینی روی ژل SDS-PAGE مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصله نشان داد که بهترین شرایط بیان در زمان القا OD600 : 0.3 و میزان IPTG یک میلی مولار و زمان انکوباسیون 6 ساعت می باشد، دراین شرایط میزان بیان پروتئین نوترکیب نسبت به پروتئین تام برابر 45.57 درصد می باشد.

سابقه و هدف: آنزیم های تجزیه کننده پروتئین یا پروتیولایتیک با انجام هیدرولیز برگشت ناپذیر پیوند پپتیدی برای ادامه بقای موجودات زنده ضروری هستند. کربوکسی پپتیدازها از جمله آنزیم های پروتیولایتیکی هستند که در موجودات بسیاری یافت می شوند و از این آنزیم ها در صنایع مختلف-مثل صنایع غذایی و داروسازی-به وفور استفاده می شود. هدف از این تحقیق، بیان آنزیم کربوکسی پپتیداز باکتری بومی کوهنلا A01، خالص سازی و سنجش فعالیت آن است. مواد و روش ها: ابتدا ژن کربوکسی پپتیداز کوهنلا A01 که در وکتور pET-26b(+) کلون شده بود؛ با ایجاد سلول های مستعد از باکتری میزبان بیانی (اشرشیاکلی BL21) وارد آن گردید. این باکتری در محیط کشت LB تلقیح و با استفاده از IPTG، بیان پروتئین القا شد. سپس سلول ها جمع آوری، شکسته شده، پروتئین بیان شده با استفاده از ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل سفاروز، تخلیص شد. یافته ها: نتایج به دست آمده مشخص نمودند که آنزیم نوترکیب بیان شده-طبق پیش بینی انجام شده-دارای ساختمان دومی با 34 درصد مارپیچ آلفا، 26 درصد صفحات بتا، 5 درصد نواحی فاقد ساختار و 35 درصد شامل لوپ و سایر ساختارها بوده، یک گلوتامات کربوکسی پپتیداز به شمار می رود. این آنزیم قادر است در دمای 50 درجه سلسیوس و pH معادل 7، ریشه گلوتامات را از اسید فولیک جدا نماید. وزن مولکولی آن kDa 6/41 بوده، فعالیت محاسبه شده این آنزیم (با سوبسترای فولات) در شرایط سنجش، U/ml 179 است. نتیجه گیری: باتوجه به این که گلوتامات کربوکسی پپتیداز (کربوکسی پپتیداز G) دارای کاربرد دارویی است و کربوکسی پپتیداز نوترکیب کوهنلا A01 دارای مقاومت گرمایی و در نتیجه پایداری مناسب در دمای محیط است، به احتمال می توان از این آنزیم پس از بهینه سازی، در مصارف دارویی استفاده نمود.

کلزا (Brassica napus L.) یکی از مهمترین گیاهان زراعی روغنی می باشد. یکی از بیماریهایی که باعث کاهش محصول کلزا می گردد بیماری پوسیدگی ساقه می باشد که توسط قارچ Sclerotinia sclerotiorum ایجاد می شود. پروتئینهای مرتبط با بیماریزایی (PR) توانایی ایجاد مقاومت علیه پاتوژنهای قارچی را دارد. پروتئینهای شبه توماتینی (TLPs) نشان داده اند که دارای فعالیت ضد قارچی علیه طیف وسیعی از پاتوژنهای قارچی می باشند. در این مطالعه ژن tlp جدا شده از گیاه چاودار به گیاه کلزا منتقل شده است. قطعه تکثیر شده (حدود 500 جفت باز) شناسایی و توسط الگوی هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفته و به وکتور pUC19 منتقل گردید. سازه بدست آمده پس از تایید به نام pUCNG1 نامگذاری گردید. مقایسه قطعه کلون شده با ترادفهای DNA موجود نشان می دهد که این ژن بدون اینترون می باشد. ژن tlp پروتئینی با 173 اسید آمینه و وزن ملکولی 17.7 کیلودالتون را کد می نماید. ترادف اسید آمینه ای TLP مورد مطالعه، مشابهت معنی داری را با TLP چاودار و دیگر گیاهان از خود نشان می دهد. برای بررسی فعالیت ضد قارچی این پروتئین، از بیان این پروتئین در گیاه تراریخت کلزا استفاده گردید. بدین منظور سازه حاوی ژن tlp که تحت کنترل پروموتر CaMV35S قرار داشت به Agrobacterium tumefaciens منتقل و با استفاده از الگوی PCR تایید و به ریزنمونه های کوتیلدونی گیاه کلزا واریته R-line Hyola308 منقل گردید. گیاهان تراریخت بدست آمده با استفاده از الگوی PCR و dot blot مورد تایید قرار گرفتند. جهت بررسی مقاومت این گیاهان به قارچ S. sclerotiorum از آزمون detached leaf assay استفاده گردید. اندازه لکه های ایجاد شده توسط قارچ مورد استفاده در برگ گیاهان تراریخت به طور معنی داری نسبت به لکه های ایجاد شده در گیاهان غیرتراریخت کاهش یافته است.

ویروس موزائیک گل کلم (Cauliflower Mosaic Virus= CaMV)نخستین ویروس گیاهی شناسایی شده دارای ژنوم DNA است که خسارت اقتصادی زیادی به گیاهان خانواده Brassicaceae وارد می­کند. تولید موفق کپسید­های این ویروس هم در تشخیص سرولوژیکی آن و هم در تشکیل ذرات شبه ویروسی Virus-Like Particles = VLPs مفید است. در این تحقیق، DNA نمونه­های گل کلم دارای علایم مشکوک به ویروس، استخراج و ژن پروتئین پوششی (Coat protein= CP) ویروس توسط آغازگرهای اختصاصی در PCR تکثیر شد. سپس توسط آنزیم­های برشی BamHI و SmaI در وکتور بیانی pGEX2TKدر پایین دست GST وارد و بعد از تایید وکتور نوترکیب، توالی­یابی انجام شد و توالی بدست آمده در پایگاه داده NCBI با برنامه BLASTn با توالی­های موجود در بانک ژن مقایسه شد و مشخص گردید که این توالی مربوط به ویروس CaMV با شماره دسترسی KF357590.1 در پایگاه NCBI است. بیان پروتئین CP در باکتری E. coli سویه Rosetta القاء و بهینه­سازی شد. بیان بسیار بالای این پروتئین در دمای 37 درجه سانتی­گراد و شش ساعت پس از القا به کمک IPTG با غلظت نهایی 1mM بدست آمد. سپس این پروتئین با نانوذرات سفاروز که توانایی اتصال به GST را دارند خالص­سازی و در SDS-PAGE مشاهده شد. پروتئین­های خالص شده CP با میکروسکوپ الکترونی بررسی شد و ذرات شبه ویروسی (VLPs) مشاهده گردید. تصاویر مربوط به میکروسکوپ الکترونی تولید VLPs این ویروس را بدون ایجاد اینکلوژن بادی و با مونتاژ صحیح تائید می­کند که می­تواند در حمل دارو در پزشکی مورد آزمایش قرار گیرد.

قارچهای بیماریزای کلزا که سالانه خسارت زیادی را به این محصول وارد می کنند برای نفوذ در گیاه، با ترشح آنزیمهایی باعث تجزیه مولکولهای دیواره سلولی آنها می شوند. در طی تکامل در گیاهان، پروتئینهایی برای مهار این آنزیمها بوجود آمده است. PGIP1 از جمله این پروتئینها بوده که قدرت نفوذ قارچ در گیاه را مهار می نماید. در این تحقیق با توجه به اینکه آنتی بادی علیه پروتئین PGIP1 لوبیا به صورت تجاری موجود نمی باشد و از طرفی جهت تایید بیان PGIP1 در گیاهان کلزای تراریخت بدست آمده نیاز به آنتی بادی مربوطه می باشد، لذا اقدام به تولید پروتئین PGIP1 در سیستم پروکاریوتی و استفاده از آن جهت تولید آنتی بادی علیه آن گردید. بدین منظور ژن کد کننده PGIP1 کلون شده در pUC19 بوسیله آغازگرهای اختصاصی RB وRB2H  (به ترتیب حاوی سایتهای Nde1 و Xho1) تکثیر و پس از هضم با این دو آنزیم در ناقل pET26b (+) کلون گردید. پلاسمید حاصله پس از تاییدهای مولکولی به میزبان بیانی E. coli BL21 (DE3) pLysS منتقل گردید. جهت بهینه سازی شرایط بیان ژن مورد نظر، شرایط مختلفی شامل، غلظتهای متفاوت IPTG، دماهای متفاوت کشت و OD زمان القا در کلونیهای متفاوت مورد بررسی قرار گرفت و نهایتا OD=0.3، دمای 37 درجه سانتی گراد وIPTG=0.5mM  بعنوان بهترین شرایط بیانی معرفی گردید. از آنجا که توالی هیستیدین در انتهای پروتئین کد شده وجود دارد، جهت تایید بیان پروتئین PGIP1 توسط آزمون وسترن بلات از آنتی بادی Anti-His استفاده گردید. پروتئین خالص شده در شش نوبت به دو خرگوش تزریق شد. جهت بررسی میزان تیتر آنتی بادی از آزمون الایزا استفاده گردید. از آنتی بادی تولید شده جهت تایید بیان پروتئین PGIP1 تولید شده در گیاهان کلزای تراریخت استفاده گردید. نتایج حاصل از آزمون وسترن بلات وجود پروتئین مورد نظر را در پروتئینهای استخراج شده از برگ گیاهان کلزای تراریخت در مقایسه با کلزای غیر تراریخت تایید نمود.

اتانل به عنوان یک سوخت زیستی تجدید پذیر جایگزین مناسب و بی نقصی برای سوخت های فسیلی چالش بر انگیز به نظر می رسد. باکتری گرم مثبت باسیلوس سوبتیلیس توانمندی های ذاتی مثبت متعددی برای تبدیل شدن به یک باکتری تولید کننده اتانل نشان میدهد از جمله توانایی تخمیر طیف گسترده ای از قند های حاصل از هیدرولیز زیست توده لیگنوسلولزی. تبدیل این باکتری تجزیه کننده سلولز به یک باکتری تولید کننده اتانل، با روشهای مهندسی متابولیک و از طریق وارد کردن اپرون تولید اتانل از باکتری زیموموناس موبیلیس به دو فرم پلاسمیدی و اپی زومال، صورت گرفت و در نهایت سویه های SR1، SR21 و SR22 ایجاد شدند. در سویه های SR21 و SR22 ژن لاکتات دهیدروژناز نیز حذف شد، این سویه ها اهمیت تولید کوفاکتور NAD+ و تاثیر آن بر رشد بی هوازی باکتری را نشان دادند. با توجه به نقش یون Fe2+ در فعالیت آنزیم الکل دهیدروژناز II و تامین NAD+، بررسی میزان تولید اتانل در سویه های نوترکیب در حضور این یون انجام شد و تاثیر مثبت آن در بهبود رشد سویه ها در شرایط بی هوازی نشان داده شد. در نهایت بازده تولید اتانل توسط سویه های SR1، SR21 و SR22 به ترتیب 8/53%، 7/86% و 9/83% بود.

لاکتوکوکوس لاکتیس (L. lactis) یک باکتری گرم مثبت از گروه باکتریهای اسید لاکتیکی LAB (Lactic Acid Bacteria) است که قدمت طولانی در فرآوری و تولید محصولات لبنی دارد. ویژگیهای منحصربفرد این باکتری (از جمله: رشد سریع، تراکم بالای سلولی، قابل استفاده بودن در صنایع تخمیری، عدم تشکیل اجسام انکلوژن (Inclusion body)، نمایش سطحی (Surface display)، عدم تولید اندوتوکسین، فاقد فعالیت پروتئازی خارج سلولی و دارا بودن کمترین فعالیت پروتئازی داخل سلولی، و مهمتر از همه قابلیت ترشح خارج سلولی پروتئین ها) باعث شده است تا بعنوان یک میزبان بی خطر و مناسب برای تولید پروتئینهای نوترکیب یوکاریوتی، در تحقیقات و صنعت مورد توجه و استفاده قرار گیرد. این باکتری از یک سو یک کارخانه سلولی برای تولید طیف گسترده ای از آنتی ژنهای پروتئینی و از سوی دیگر بعنوان میزبانی مناسب برای تحویل یا رساننده پروتئینهای درمانی و مولکولهای فعال زیستی به داخل سلول بشمار می آید. برای این منظور، وکتورهای بیانی اختصاصی و سویه های باکتریایی متعددی برای بیان و تولید پروتئینهای نوترکیب طراحی شده اند که در این مقاله مروری به شرح آنها پرداخته شده است.